产品货号：
KD2086
中文名称：
毕赤酵母感受态制备与转化试剂盒
英文名称：
Pichia pastoris receptive Preparation and Conversion Kit
产品规格：
20T|100T
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
保存：-20℃
储存条件：-20℃保存，未开封有效期24个月。
产品内容：
一、毕赤酵母感受态细胞的制备
1.活化菌种。-80℃保存的菌种在固体YPD培养基平板上划线，30℃培养2～4天。
2.选取酵母菌落接种到10mL液体YPD培养基中，30℃摇床过夜培养后将培养物按1%的接种量接种到100mL液体YPD培养基中三角瓶中培养至OD值为0.6～1.0。
注：每10mL菌液可用于一次转化。以下操作步骤适用于10mL菌液。
3.3000rpm离心3min收集菌体沉淀。
4.加入5mL B1溶液重悬菌体，3000rpm离心3min收集菌体沉淀。
5.再加入200μL B1溶液重悬菌体，转移到无菌1.5mL离心管，即为制备好的感受态细胞，可直接用于转化或冻存备用。
6.制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒，或用多层纸包裹放入泡沫盒中，先置于-80℃冰箱过夜后，再取出感受态置于-80℃冰箱，可保存半年。使用前冰上解冻或直接用于转化。
注：缓慢冷冻会保证良好的转化效率。扩大酵母菌培养体积，相应增加冻存液的使用量，可以一次性制备多只毕赤酵母感受态细胞。
二、毕赤酵母转化
1.取0.1～5μg质粒DNA(线性化质粒加入量5～50μg)和10μL预变性Carrier DNA加入到未融化的感受态细胞上，置于30℃水浴，每隔15 s颠倒混匀，直至感受态细胞刚好完全融化。(融化后及时取出)
2.加入1.4mL B2溶液颠倒混匀。30℃水浴60min。
3.3000rpm离心3min弃上清留菌体沉淀，加入1mL B3溶液重悬菌体。
4.3000rpm离心3min弃上清留菌体沉淀，加入100μL B3溶液重悬菌体。
5.将100μL菌液全部涂布到相应的平板培养基，30℃恒温培养3～5天，直至平板出现酵母克隆。
注意事项：初次使用Carrier DNA，请把装有Carrier DNA的管子在沸水中煮沸5min，然后立即放在冰上，用后放在-20℃储存备用。下次使用前请于冰上解冻Carrier DNA。反复冻融3～5次后需重新变性Carrier DNA。
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